溶菌酶及其在抗菌杀菌技术领域中的应用

    溶菌酶（E.C，3.2.1.17）是由英国细菌学家弗莱明在1922年发现的[1]，它广泛存在于自然界动物、植物和微生物中，其全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。大量研究证明，溶菌酶由单核-巨噬细胞分泌，是溶酶体酶的一种，作用于细菌和部分真菌的细胞壁肽聚糖，是一种高效的抗菌剂，它能切断肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起菌体裂解死亡[2]。人和动物的细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对其没有毒性作用。

1 溶菌酶的来源和分类
    1963年乔利斯和坎菲尔德研究了溶菌酶的一级结构，两年后英国的菲利普及其同事们用X射线衍射法解析了溶菌酶，这是世界上第一个完全弄清了立体结构的酶，是近代酶化学研究的最大成果之一。溶菌酶广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中以及哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿液、乳汁、白细胞及其他体液和组织（如肝、肾）细胞内，从大麦、芜菁、无花果、木瓜、卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清中含量最高（约0.3%），但人乳、眼泪、唾液中的溶菌酶活性却远高于蛋清中（约为3倍）或其他来源的溶菌酶的活性[3]。除了这些天然原材料外，现在还可以通过基因工程手段获得溶菌酶。
    例如人溶菌酶（ humanlysozyme，hLY）是由130个氨基酸残基组成，相对分子量14700kb。国内外有很多关于hLY基因克隆、表达的报道。Takaki报道用基因化学合成方法合成hLY的全基因（包括hLY前体信号肽的18个氨基酸残基基因），并将它转至酵母菌细胞中表达，获得高效表达的hLY。Maria报道从人体组织细胞系U-937提取总RNA，经逆转录为cDNA后克隆至真核表达载体中表达。钱世钧等报道用基因化学合成的方法合成hLY的全基因（基因序列是根据大肠杆菌偏爱的密码子设计，不包括hLY的前体信号肽部分），克隆至原核表达载体中进行了高效表达。
    蛋清溶菌酶可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对一些常见的致病细菌如大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌基本上不起作用，由此可见，虽然蛋清溶菌酶含量最丰富，但杀菌范围小，作用有限。人或动物的溶菌酶则具有广谱的杀菌效果，并具有生物相容性好、对组织无刺激、无毒性的特点，最早是从人或动物的乳汁、胎盘中提取，由于来源困难，提取方法复杂，不能进行大规模工业化生产。所以采用基因工程技术，从细菌或酵母中生产溶菌酶是解决其供需矛盾的主要途径。
    根据溶菌酶的不同结构可将其分为C型、G型和噬菌体型溶菌酶[4]。C型溶菌酶由129或130个氨基酸残基组成，相对分子量约为14700kb，其活性中心为Glu-35、Asp-52、Trp-62和Trp-108，是唯一同时存在于脊椎动物、原索动物（文昌鱼）和无脊椎动物中的类型，也是目前研究得最广泛、最透彻的类型，大部分溶菌酶都属于C型，鸡蛋卵清溶菌酶、从人的乳汁、尿液、胎盘中提取的溶菌酶都属于C型。G型溶菌酶即鹅卵清溶菌酶，约含185个氨基酸残基，相对分子量为21000kb。噬菌体溶菌酶存在于各种噬菌体内，对溶解宿主菌起重要作用，它含有164个氨基酸残基，相对分子量为187000kb。

2 溶菌酶的理化特性
    溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基及芳香族氨基酸如色氨酸的比例很高。溶菌酶是非常稳定的蛋白质，pH在1.2～11.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，对于溶菌酶的活性来说，最理想的条件是pH6.0～7.0。溶菌酶遇热也很稳定，pH4.0～7.0，100℃处理1min仍能保持原酶活性；pH5.5，50℃加热4h后，酶变得更活泼。它的热变性是可逆的，变性的临界点是77℃，随溶剂的变化变性临界点也有变化，当变性剂pH在1以下时，变性临界点降到43℃。一般说来，变性剂能促进酶的热变性，但变性剂过量时，溶菌酶的热变性不可逆。在碱性环境中，用高温处理时，酶活性降低。氧化剂也能对酶的活性起阻遏作用，而食盐则相反能起活化作用。粉状溶菌酶若采用低温干燥贮存，几乎可长期不变质。即使在pH为中性的水溶液中，该酶也可维持数天而不损失其活性。

3 溶菌酶在抗菌杀菌技术领域中的应用
    溶菌酶是一种天然抑菌、杀菌蛋白质，具有其他物理和化学杀菌因子所不具备的安全性、无污染等特性。这就决定了它将在各类抗菌杀菌技术领域中有广泛的应用。

3.1 食品保鲜防腐
    溶菌酶是一种天然存在的蛋白质，无毒无害，可直接用于食品的防腐保鲜。张凤凯等成功研究了一种溶菌酶冷却肉保鲜剂Hnsafety-008，该保鲜剂完全采用安全、无毒、天然的物质科学的配比而成，可以延长冷却肉的保质期1-4倍。并且该保鲜剂可耐受95℃以下的温度，而保持性质稳定。溶菌酶也可用于乳制品的防腐，在奶酪加工过程中添加一定量的溶菌酶可以防止中后期奶酪的起泡、变味，还可以保持奶酪老化过程中奶酪基液的品质，更重要的是其123014 April 总第三十八期可以起到长期的杀菌作用，有效控制酪酸的发酵。除此之外，溶菌酶也可用于食品软包装材料的抗菌保鲜、酒及饮料的防腐、水产品的杀菌消毒等方面。

3.2 空气净化杀菌
    空气中的细菌是吸附在尘埃微粒上的，常见的致病菌有结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、百日咳鲍特菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、脑膜炎奈瑟菌、军团菌等，可引起呼吸道传染病或伤口感染，考虑到安全因素，通常采用玻璃纤维HEPA等过滤器对空气进行过滤净化除菌。然而，微生物容易在HEPA上繁殖、扩散，形成二次污染。国内有人研究成功了一种溶菌酶PPHEPA过滤器，它将溶菌酶固载在HEPA的整个滤纸纤维上，可以在纤维内部捕捉杀灭微生物，有效地防止二次污染。

3.3 口腔杀菌消炎
    细菌是口腔疾病发生的主要原因，龋齿、牙髓炎、根尖周炎和部分口腔黏膜病都和口腔细菌的感染密不可分。溶菌酶目前已经应用于口腔疾病的预防和治疗。在口腔内应用溶菌酶可以修复组织，有利于口腔溃疡的愈合。溶菌酶与增效剂、稳定剂还可制成口腔清洁液，对几种引起口腔疾病的致病菌，如葡萄球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌等有抑杀作用，经过检测，5min内杀菌率达99.9%。急性毒性试验、蓄积毒性试验、微核试验、黏膜刺激试验等安全性评价，均符合要求。体外杀菌试验也证明，溶菌酶复合制剂能有效抑制和杀灭口咽部致病菌，可以有效治疗急慢性咽炎、扁桃体炎等口腔疾病。

3.4 医疗中皮肤的抗菌、杀菌护理
    肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成成分，溶菌酶可水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡糖胺（NAG）中的β-1,4糖苷键，在渗透压作用下导致细菌细胞壁破裂，发生溶菌作用。在体内环境下，由于有分泌型免疫球蛋白A、补体参与，溶菌酶还能水解某些革兰氏阴性菌，如Ecoli等。由于真菌细胞壁中NAM和NAG之间形成的β-1,4糖苷键（几丁质）也是溶菌酶作用的底物，所以溶菌酶可以抗含有几丁质细胞壁的真菌感染。溶菌酶还能与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并增强抗生素和其他药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而有利于修复被炎症损伤的组织。人溶菌酶能激活血小板，改善局部组织循环障碍，分解脓液，增强局部防卫，从而更好地抗菌、消炎、止痛。

3.5 溶菌酶在擦伤、烧伤创面感染中的应用
    耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ Methicillin-resistant taphylococcus aureus,MRSA）是烧伤创面感染的主要菌株之一，近年来感染发生率不断上升，由于多种抗生素和创面外用药物的使用及菌株的变异，出现了MRSA及中间型抗万古霉素金黄色葡萄球菌等耐药菌株，其感染程度难以控制，导致创面不愈合。李罗珠等用复合溶菌酶治疗190例烧伤患者，使用48.96h后，对MRSA的有效率
    98%～100%，对中间型抗万古霉素金黄色葡萄球菌的有效率为10%～33%，从而证明复合溶菌酶对MRSA及中间型抗万古霉素金黄色葡萄球菌有显著的杀菌效果，是治疗烧伤创面感染的用药选择之一。
    目前临床上应用的溶菌酶很多是鸡蛋清溶菌酶，由于它是一种异源蛋白，在动物体内会产生免疫原性和副作用。通过基因工程获得的溶菌酶则不然，它本来就是动物体内的一种蛋白质，和动物体具有天然相容性，而且其抗菌、杀菌作用更强，因此，采用基因工程技术,从细菌或酵母中生产人或动物的溶菌酶，开发新的溶菌酶资源，降低生产成本，才能促进溶菌酶在实践中的应用。随着医药技术的发展，对溶菌酶的需求量也日益增大，溶菌酶必将在将来的医疗中发挥越来越大的作用。

参考文献
   [1] Fleming A.On a remarkable bacteriolytic element found intissues and ecretions[J]. Proc R Soc Lond B Biol Sci,1922,93:306.
   [2] 贾向志,李元. 溶菌酶的研究进展[J]. 生物技术通讯, 2002, 13(5):374～377.
   [3] 林向阳. 溶菌酶及其应用研究[J]. 中国食品添加剂, 2005,10(6):103～106.
   [4] Imoto T. Enjoying Research on ysozyme for 42 years[J].Yakugaku asshy, 2003, 123(6):377～386.