草酸分解菌对尿石病防治的研究进展

摘要：
    草酸钙结石是泌尿系结石中发病率较高的一种，其形成原因主要是尿液中草酸浓度过高，易与钙离子生成草酸钙结晶，从而进一步形成草酸钙结石。产甲酸草酸杆菌、乳酸杆菌等草酸分解菌可以分解肠道中的外源性草酸，减少尿液中草酸含量，从而降低结石病发生的风险。

关键词：草酸钙结石；草酸分解菌；草酰辅酶A脱羧酶；甲酰辅酶A转移酶

    尿石症是泌尿系统的常见疾病之一，发病率高，病因复杂。据医学统计及流行病学调查，目前患尿石病的人数比二十世纪初至少多十倍，其中草酸钙结石的发病率约占泌尿系结石总发病率的60%～80%[1]；另据美国明尼苏达州尿结石中心统计，犬的草酸钙尿结石在所有结石种类中的比例从1981年的5%上升至2005年的41%[2]。草酸钙结石的形成主要与尿液中草酸根离子的浓度有关[3]，控制肠道中草酸的吸收量是预防此类尿石症的有效方法之一。近年来的研究发现，脊椎动物的肠道中能够定植一些分解草酸的细菌，可以降低体液中的草酸浓度，使草酸盐晶体形成的几率减小，从而可以降低结石病发生的风险。

1 草酸钙结石的形成机理
    泌尿系结石的病因复杂，与代谢异常、遗传、尿路感染、饮食结构等均有不同程度的关系。当尿液胶体和晶体平衡失调时，尿中的盐类发生沉淀；尿液pH值、温度、离子强度等变化均可促使沉淀生成；某些细菌感染时尿路上皮细胞脱落，会促使结石核心形成；饮水量不足，尿的无机物浓度增高，也可诱发晶体物质沉淀而形成结石。草酸钙结石的成石因素包括高草酸尿、高钙尿、低尿量、低枸橼酸尿、高尿酸尿及成石抑制物缺乏等，其中最重要的成石原因为尿中草酸浓度过高。草酸钙结石的发生与机体内钙离子和草酸根离子的浓度都有关系，如果它们长期处于过饱和状态，就容易结合形成草酸钙晶体。由于动物体内缺乏降解草酸的酶，尿中草酸根离子浓度增加以后，其危险性比尿钙浓度的增加所造成的危险性大10-15倍。
    草酸钙结石的形成过程较为复杂，大致过程如下[3]：在结石的致病条件（如高草酸尿）下，在远曲肾小管腔内或肾小管细胞内形成结晶，肾组织局部草酸浓度也会增高，最初形成的结晶使晶体继续生长、凝集、黏附、滞留在肾小管腔内上皮细胞并形成结石颗粒。较高的尿草酸浓度诱发巨噬细胞聚集，吞噬草酸和草酸钙结晶，同时释放骨桥素和钙防素，在细胞因子的参与下，形成结石核心，并向管腔脱落，形成结石。草酸、草酸钙晶体是结石形成过程中最重要的因素。
    近年发现，草酸、草酸钙晶体对肾脏上皮细胞有毒性作用，它们和上皮细胞作用产生毒性物质造成上皮的损伤，同时上皮细胞也主动摄入晶体、分泌大分子物质，二者相互作用最终可导致结石的形成。Thamilselvan等的研究表明，草酸及草酸钙可诱发脂质过氧化反应而损伤上皮细胞，也可诱发肾脏上皮细胞产生一系列细胞因子而引发炎症，最终细胞变性、坏死，细胞基底膜暴露而有利于结石的形成；Umekawa等指出，草酸钙晶体可使肾小管上皮细胞产生大量的单核细胞趋化蛋白-1，它是一种趋化因子，可以趋化、激活单核巨噬细胞，这些细胞聚集介导炎症的发生从而损伤肾脏各细胞群。肾脏上皮细胞在经历各种原因所致的损伤后可以通过大分子物质之间的识别，迅速而牢固的黏附于上皮细胞膜而发生滞留，启动结石形成的级联反应，其机制大致包括：改变细胞膜性质促使晶体黏附；细胞活力改变提供可成核的碎片；激活的细胞溶质中的磷脂酶A2触发信号级联放大而产生数个脂质介质（花生四烯酸、溶血磷脂胆碱、神经酰胺）作用于细胞内的线粒体、细胞核。总的作用结果是一些细胞因活性氧的毒性作用而死亡，加速了结石的形成。
    机体内草酸的来源大致有两种途径，其一是人体代谢的终端产物，即内源性草酸，主要经尿液排出；另一途径是从食物中摄取的外源性草酸，它经消化道吸收以后成为尿中草酸的重要来源。

2 草酸分解菌与尿石症
    草酸分解菌是指可以分解动物机体内的草酸，从而降低尿草酸含量的肠道益生菌群。如：产甲酸草酸杆菌（Oxalobacterformigenes）、乳酸杆菌（Lactobacillus）、粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）和迟缓真杆菌（Eubacterium lentum），由于这些细菌能利用草酸作为能源，使肠道中的草酸含量减少，所以有利于预防草酸钙结石的形成。

2.1 产甲酸草酸杆菌
    产甲酸草酸杆菌属于革兰氏阴性厌氧菌，以草酸作为其产生ATP的唯一能量来源和细胞碳源，在有氧及碳源贫乏时都不能生存。产甲酸草酸杆菌在人体结肠内多达107个，分解草酸的速率可达0.5～1g/d，是维持动物及人体内草酸稳定的主要细菌，其通过调节肠道的草酸吸收量而控制尿液和血浆中的草酸含量。聚合酶链反应（PCR）检测发现：健康志愿者（40例）中阳性检出率为65%，而草酸钙结石病（63例）首次及复发2次患者检出率为35%，复发3次以上者只有5.6%。草酸钙结石的复发率与产甲酸草酸杆菌的阳性检出率成反比[4]。
    产甲酸草酸杆菌分解草酸的机理如下：由568个氨基酸组成的分子量约为60,000的草酰辅酶A脱羧酶（OXC）催化硫胺焦磷酸依赖性脱羧反应，使草酸辅酶A通过还原反应生成甲酸和CO2，同时生成甲酰辅酶A；由428个氨基酸组成的分子量约为47,000的甲酰辅酶A转移酶（FRC）将甲酰辅酶A上的辅酶A转移回草酸，重新生成草酰辅酶A，为OXC提供底物。在被利用的草酸中，99%经脱羧基生成比例约为1︰1的甲酸和CO2，只有1%的碳吸收为生物当量，经过系列生物合成途径合成3-磷酸甘油酸酯。

2.2 乳酸杆菌
    乳酸杆菌属于益生菌，人类对乳酸杆菌有着久远的安全食用史，广泛应用于乳制品发酵、工业发酵等行业中。Campieri等证实乳酸菌具有降解草酸的能力。通过对6例草酸钙结石病伴有特发性高草酸尿症的患者口服乳酸杆菌的治疗观察，治疗30天后，其尿草酸排泄量从（55.5±19.6）mg/d显著降低到（35.5±13.9）mg/d。由于体内寄生了乳酸杆菌，60天后患者的尿草酸能持续降低到（28.3±14.6）mg/d，其中2例患者粪便中的草酸排泄量降低了40.3%。这些数据表明口服大量混合乳酸菌能有效分解肠道中的草酸，减少草酸吸收量。
    张士青等对于市场上酸奶中常见的3种菌（酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）进行体外分解草酸能力的研究。实验证实，3种菌及这3种的混合菌均有不同程度降解草酸的能力。在底物草酸浓度相同的情况下，嗜酸乳杆菌的分解草酸能力最强，在细菌浓度相近的情况下，嗜酸乳杆菌在10mmol/L的草酸环境中，72h内分解草酸率为9.4%，在20mmol/L的草酸环境中，72h内分解草酸率为8.2%。Federici等对主要用于各种益生菌制品的12种双歧杆菌菌株进行降解草酸活性的测定，结果乳双歧杆菌的活性最高，经过5天培养，降解了5mmol/L草酸培养液中60%的草酸。本实验室研究了不同培养基条件下乳双歧杆菌对草酸的分解情况，结果表明，在适当的碳源和氮源比例下，乳双歧杆菌对草酸的分解率最高可达到15%。对乳双歧杆菌降解草酸的机制研究发现，它拥有与产甲酸草酸杆菌相同的草酸分解酶，即草酰辅酶A脱羧酶（OXC）和甲酰辅酶A转移酶（FRC），这意味着乳双歧杆菌能够利用草酸作为能量来源。此外，在嗜酸乳杆菌和加氏乳杆菌的某些菌株中也发现了表达这两种酶的基因，从理论上证明它们也具有分解草酸的能力。

2.3 粪肠球菌   
    粪肠球菌是一种在厌氧环境下从人类的粪便中分离出来的草酸分解菌，但并非所有的菌株都能分解草酸。在具有分解草酸能力的菌株中提取到了3种蛋白质（40、48、65kDa），草酰辅酶A脱羧酶抗体和甲酰辅酶A转移酶的抗体分别能与65kDa和48kDa的蛋白质进行反应，说明在粪肠球菌中同样存在能够分解草酸的酶。由于整个细菌的裂解产物可以降解草酸，而游离细胞培养基的超悬浮物却无此能力，所以估计这些酶存在于细菌体内，从整个细胞裂解产物中得到的蛋白质不能直接降解草酸，说明这些酶需要辅助因子的参与才能发挥作用。分子量为40 kDa的蛋白质，可能与产甲酸草酸杆菌菌膜上的质子泵OXIT所起的功能相同，起转运草酸和甲酸的作用。由于以上三种蛋白质也都存在于产甲酸草酸杆菌中，所以这两种细菌代谢草酸的机理可能很相似。
    机体中的高浓度草酸是引起泌尿系结石的一个重要因素，大部分的草酸来源于饮食，通过肠道吸收而影响尿草酸的含量。草酸分解菌能够吸附定植在肠道中，作为益生菌发挥分解草酸、调节微生态平衡的作用，对预防和治疗常见的尿石症具有重要意义。

参考文献
[1] 韩跃辅,王勤章.机体代谢与尿石症形成的相关性研究进展[J].医学综述,2009,15(7):1040.
[2] Osborne C A, Lulich J P. Perspective:Analysis of 275000 uroliths[J]. DVM: The News magazine of Veterinary Medicine,2006, 37(7):60-63.
[3] 代海涛, 陈志强, 叶章群. 草酸、草酸钙晶体—上皮细胞相互作用与肾结石[J]. 国际泌尿系统杂志, 2006, 26(2):254.
[4] Ruan X Z, et al. Dysregulation of LDLreceptor under the influence of inflammatory cytokines: a new pathway for foamcell formation [J]. Kidney Int., 2001,60(5):1716-1725.