肠道细菌草酸分解能力的体外比较研究

摘要：
    研究了几种肠道细菌在体外培养基中的草酸分解能力，为防治草酸钙结石提供了实验依据。将不同的目的菌株分别接种在MRS培养基中，37℃厌氧培养48h进行活化。将各纯化后的菌种分别接种在不同草酸浓度的培养基中，设置空白对照组，培养24h后离心过滤，用高效液相离子色谱法分析培养基中草酸的浓度变化。结果表明，所有培养基中的草酸浓度均有不同程度的下降，其中乳双歧杆菌组的降幅最大；环境草酸浓度超过一定数值后，各细菌的草酸分解率降低，细菌的繁殖速度也减慢。由此可见，这三种肠道细菌的草酸分解能力不同，乳双歧杆菌最强，其次是嗜酸乳杆菌，粪肠球菌的草酸分解能力最弱。

关键词：乳双歧杆菌  嗜酸乳杆菌  粪肠球菌  草酸分解率

    微生态制剂是以正常微生物菌群或其促进物质制成的活的微生物制剂，其在维护肠道菌群平衡、提高机体免疫力、促进动物生长等方面作用显著[1]。随着对肠道菌群研究的深入，一些新的功能被发现并证实，肠道的草酸吸收对泌尿系草酸钙结石的影响正渐渐被重视。
    在动物的肠道中，有一些能够分解草酸的益生菌群，如：乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌等，通过它们的作用，可以降低尿中草酸的含量，从而减少草酸钙结石形成的几率。乳双歧杆菌是动物双歧杆菌的一个亚种，已被列入了国际乳品联合会（IDF）有关人类食品的安全微生物目录；它拥有良好的胃肠道表现，具有很强的黏附于动物肠道上皮细胞的能力，能高度耐受胃酸和肠道环境中的胆汁盐[2]；分子水平的研究还发现，其具有分解草酸的关键酶-甲酰辅酶A转移酶的表达基因，能够分解体内的草酸。另外有研究实例证明，嗜酸乳杆菌也能减少草酸钙结石患者（伴轻微高草酸尿）的草酸排泄量。根据免疫学原理进行的实验证实，粪肠球菌中也存在能够分解草酸的酶。本实验研究了几株不同的肠道细菌对草酸的分解能力，为预防和治疗草酸钙结石病寻找新的方法依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株
    乳双歧杆菌（BNS-03），嗜酸乳杆菌（BNS-02），粪肠球菌（BNS-01）

1.1.2 主要试剂
    草酸钠，无水葡萄糖；牛肉膏，蛋白胨，酵母粉；磷酸氢二钾、磷酸二氢钾；硫酸铵，九水硫化钠，氯化铵，七水硫酸镁，硫酸锰，硫酸亚铁，半胱氨酸盐酸盐；氢氧化钾；柠檬酸，碳酸氢钠，硼氢化钾，吐温80，碳酸钙，琼脂；草酸钠（色谱纯），甲酸钠（色谱纯）。

1.1.3 主要仪器和设备
    戴安离子色谱仪ICS-3000，色谱柱：DIONEX  IonPac  AS11-HC 4×250mm，超净工作台，高倍显微镜，厌氧罐，高压蒸汽灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及培养
    将安瓿开封，用无菌吸管吸取适宜（0.3-0.5毫升）的液体培养基，滴入安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，吸取全部菌悬液移植于MRS培养基试管中[3]。
    配制不同草酸浓度的液体培养基，并于121℃灭菌20min，其中草酸含量分别为0.15%、0.25%、0.35%，其它成分及含量为：磷酸氢二钾0.025%，磷酸二氢钾0.025%，硫酸铵0.05%，七水硫酸镁0.0025%，酵母粉0.1%，蛋白胨0.1%，刃天青0.0001%碳酸钠0.4%，一水盐酸半胱氨酸0.05%。各细菌的草酸分解率和细菌增殖倍数分别代表其草酸分解能力和耐草酸生长能力。
    草酸分解率=草酸分解量/对照组草酸浓度×100%
    细菌增殖倍数=培养后细菌浓度/培养前细菌浓度

1.2.2 厌氧培养方法
    将接种后的培养皿或试管置于厌氧罐中，称取柠檬酸钠1g、碳酸氢钠1g、硼氢化钾2g混匀包装放入厌氧罐中，密封罐体，从上孔加入适量水后迅速封口，待罐内形成无氧环境后置于37℃培养18-24h。对照组为未接种的相应培养基，处理方法同上。

1.2.3 代谢产物的离子色谱分析
    配制草酸钠和甲酸钠的一系列浓度标准溶液（0.1%-0.5%），作为色谱分析的对照液。
    将培养后的菌液置于离心管中，4000r/min离心15min，取上清液，经0.2um滤膜过滤后进行离子色谱分析。分析条件如下：
    柱温：30℃
    进样量：10ul
    流动相：不同浓度的KOH溶液梯度洗脱
    表1 KOH溶液梯度洗脱过程

2 结果与讨论

2.1 不同细菌分解草酸的能力
    在草酸含量为0.25%的培养基中，经过24h培养后，检测培养基中的草酸含量，结果见表2。
    表2 不同细菌培养后的草酸分解情况

    由实验结果分析可知，所有培养基中的草酸浓度都有不同程度的下降，而各细菌组的草酸浓度降幅均大于对照组（P＜0.05）。在含相同草酸浓度的条件下，各菌种的草酸分解率由高至低依次为：乳双歧杆菌＞嗜酸乳杆菌＞粪肠球菌。乳双歧杆菌的分解草酸能力最强，当初始菌量为3.2×107CFU/mL时，在0.25%的草酸环境中草酸分解率为16%。

2.2 环境草酸浓度变化对细菌草酸分解率的影响
    通过改变培养基中草酸的浓度来检测细菌在不同环境下的草酸分解能力，实验结果如图1。随着环境草酸浓度的升高，同一菌种的草酸分解率呈先上升后下降趋势（图1），在0.15%的草酸环境中，乳双歧杆菌在24h内的草酸分解率为14.5%，嗜酸乳杆菌的分解能力居中，粪肠球菌最弱，当初始菌量同样为3.2×107CFU/mL时，在0.35%和0.25%的草酸环境中，粪肠球菌在24h内的草酸分解率分别为0.5%和4.1%。由此可见，环境中的高浓度草酸对细菌的分解能力有抑制作用，但对各菌种的抑制程度不一，嗜酸乳杆菌和粪肠球菌受抑制明显高于乳双歧杆菌。
    图1 环境草酸浓度变化对细菌草酸分解率的影响

3 结论
    在草酸钙结石的形成过程中，尿中的草酸浓度至关重要，它的轻微变化就能明显影响肾小管中草酸钙结晶的生成。动物体内的尿草酸大多来源于外源食物的吸收，通过肠道进入体液循环，因此，减少肠道对草酸的吸收量对预防草酸钙结石有积极的作用。近年来的研究发现，脊椎动物肠道中的常驻益生菌群如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、迟缓真杆菌等具有分解草酸的能力。本实验结果再次证明了部分益生菌在分解草酸方面的能力，对研究预防草酸钙结石病具有重要的意义。

参考文献：
[1] 李建强.微生态制剂-XA1503菌粉的研制和应用[J].中国兽医杂志,1993(2):9-11.
[2]  贾士芳,郭兴华.活菌制剂的现状和未来[J].生物工程进展,1996,16(2):16-21.
[3]  凌代文.乳酸细菌分离鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999.